l 傳統(tǒng)手工計數(shù)方法

ELISPOT檢測的最終數(shù)據(jù)是細(xì)胞頻率（即在細(xì)胞群體中，受某種特異性抗原刺激而分泌某種細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例）。細(xì)胞總數(shù)在試驗開始已經(jīng)計數(shù)。需要統(tǒng)計的是陽性細(xì)胞（也稱斑點形成細(xì)胞（spot forming cells，SFC）數(shù)目。根據(jù)以前的技術(shù)研究，科學(xué)界已形成共識，每一個ELISPOT斑點對應(yīng)唯一一個陽性細(xì)胞。所以ELSPOT數(shù)據(jù)處理重要的工作就是進(jìn)行斑點計數(shù)。

手工計數(shù)一般是使用雙筒解剖鏡，在放大25倍的解剖鏡下，一個孔的底板剛好覆蓋一個完整的視野。實驗操作人員手持按壓式的計數(shù)器，對孔內(nèi)的斑點逐一計數(shù)。手工計數(shù)很大的優(yōu)點就是可以利用人腦的智慧與經(jīng)驗：比如可以適應(yīng)各種大小的斑點，排除各種假陽性的斑點，能辨認(rèn)復(fù)雜背景下的模糊斑點，等等。如果實驗者只是偶爾小規(guī)模的做一做ELISPOT，手工計數(shù)仍然是首選。但是手工計數(shù)也有致命的弱點。

l 手工計數(shù)效率低下、工作乏味，不能適應(yīng)高通量篩選

假設(shè)一個ELISPOT孔有200個斑點（這不能算多，一個孔可以容納上千個斑點），計數(shù)前先要定位，接著要對焦，對焦完成之后要計數(shù)至少兩遍（以保證數(shù)據(jù)的可靠性）。保守估計，這樣一個孔的計數(shù)與處理工作需要10分鐘。那么整塊板96個孔完成數(shù)據(jù)處理需要960分鐘，也就是大約兩個工作日。如果同時做5塊板的檢測，那么光是最后的數(shù)據(jù)處理就需要十個工作日，也就是兩周時間！此外，手工計數(shù)工作本身的單調(diào)、機械和重復(fù)，也是常人無法長時間忍受的。

作為對比，BioReader 4000完成一個孔只需要6-7秒鐘，完成一塊板需要10分鐘，完成五塊板的數(shù)據(jù)分析并且打印出詳細(xì)的結(jié)果報告也僅僅需要1小時。

l 手工計數(shù)很難保證統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)

我們知道，在斑點計數(shù)之前先要設(shè)定一系列的判定標(biāo)準(zhǔn)。比如斑點的形狀，圓形度，邊緣至中心的漸變梯度，半點的直徑，斑點與背景對比度，等等。然后再應(yīng)用相同的標(biāo)準(zhǔn)對所有的孔，包括實驗孔與正負(fù)對照孔進(jìn)行計數(shù)。這樣才能給出公正客觀的結(jié)果，避免出現(xiàn)事實上的“雙重標(biāo)準(zhǔn)”。但是我們知道，人的主觀性隨意性很強。即使并非出于故意，在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的時候，也難保自始至終能夠執(zhí)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)而不走樣。

作為對比，BioReader 4000可以設(shè)定各種參數(shù)與判定標(biāo)準(zhǔn)，這些參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)可以保存成單一的“方法文件”保存或者通過E-mail傳遞，任何時候、任何地點都能保證相同的讀板標(biāo)準(zhǔn)。

l 機器計數(shù)可以獲得斑點大小分布信息，手工計數(shù)做不到

從前面的1.2節(jié)我們知道，同種細(xì)胞受同種刺激物刺激，斑點大小服從正態(tài)分布。但是細(xì)胞或者刺激物任何一種改變都會導(dǎo)致不同種類的斑點產(chǎn)生，這就有可能在同一孔內(nèi)出現(xiàn)兩種或者兩種以上的斑點。

為了便于說明問題，我們來看一個實際例子。如圖8.1所示，這是某位乙肝病人用HBcAg刺激的ELISPOT結(jié)果。A是負(fù)對照，不加HBcAg刺激也出現(xiàn)了較多斑點。B是用HBcAg刺激的結(jié)果，斑點數(shù)目是增加了，但是差別不顯著。如果僅僅只是斑點計數(shù)的話，如圖D表格的倒數(shù)第二行所示，負(fù)對照比實驗孔，斑點總數(shù)為189：380，相差只有一倍。

但是仔細(xì)對比圖A、圖B，我們發(fā)現(xiàn)，圖B中似乎有兩種斑點，一種是和圖A相同小斑點，此外還有一些大的斑點。借助于機器，我們可以輕松獲得A、B孔中的斑點直徑分布圖，圖C。從圖C我們可以知道，原來實驗孔中真的有兩種斑點，分別對應(yīng)正態(tài)分布圖中的兩個峰。兩個峰的分界點在100μm處。小于100μm的斑點與負(fù)對照孔相同，是非特異性斑點，屬于細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生；大于100μm的斑點是特異性斑點，由HBcAg刺激產(chǎn)生。

由于有了充足的信息與理由，我們可以在最后斑點計數(shù)的時候，把斑點直徑的閾值設(shè)定為100μm：我們只計數(shù)大于100μm的斑點，小于100μm的斑點不予計數(shù)。這樣負(fù)對照孔與實驗孔的最終結(jié)果為3：50，相差有17倍！這比最初相差一倍的結(jié)果顯著得多。

以上的例子說明，某些場合ELISPOT圖像分析儀可以提供額外的重要信息，這是手工計數(shù)完全無法做到的。 

l 機器計數(shù)可以獲得細(xì)胞因子相對定量信息，手工計數(shù)做不到

我們知道，通過ELISPOT斑點計數(shù)可以提供陽性細(xì)胞頻率的數(shù)據(jù)。也就是說，在給定細(xì)胞群體當(dāng)中，我們可以知道有多少細(xì)胞在分泌細(xì)胞因子。但是另一方面，我們也希望知道這些細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的相對數(shù)量。尤其是在經(jīng)過某些處理的情況下，陽性細(xì)胞的頻率沒有變化，但是細(xì)胞的平均分泌量增加了。我們也希望ELISPOT檢測能夠提供這方面的數(shù)據(jù)。這種數(shù)據(jù)的獲得就依賴于ELISPOT 圖像分析儀的斑點光密度分析功能。手工計數(shù)是無法獲得的。

那么，如何來確定每個斑點代表的細(xì)胞因子數(shù)量呢？顯然斑點的面積可以作為一個度量，細(xì)胞因子分泌越多，斑點就越大。反之亦然。另外，斑點顏色深淺（也稱為：光密度）也可以作為一個度量，細(xì)胞因子分泌越多，斑點顏色就越深，反之亦然。打一個簡單的比方，把一個斑點比作一座山峰，斑點的面積就是山峰的占地面積，斑點的深淺就是山峰的高度，細(xì)胞因子的總量就是山峰的體積。那么經(jīng)過一個簡單的數(shù)學(xué)微積分處理，就可以根據(jù)每個面積單元的高度而把山峰的重體積積分出來。ELISPOT斑點光密度定量就使用的這個原理。

如圖8.2所示，這是BioReader 4000光密度分析報告。它可以提供的信息有：孔的位置、每孔的斑點數(shù)目、該孔斑點的平均光密度（Average Opt. Density）、該孔斑點的總面積（Cumulated values area）、該孔相對細(xì)胞因子分泌總量（TOD，即光密度總值）。

需要指出的是，光密度分析只能提供細(xì)胞因子分泌量的相對值，而不能提供細(xì)胞因子的絕對分泌量。原因是很顯然的，諸多因素都對斑點的大小和顏色的深淺有影響。所以我們只能通過同一次實驗，在實驗條件完全相同的情況下，比較不同細(xì)胞、不同刺激物或者不同處理帶來的細(xì)胞因子分泌量的相對變化。