引言

血球計(jì)數(shù)板一直是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞計(jì)數(shù)的金牌標(biāo)準(zhǔn)。自從18世紀(jì)在法國(guó)第一次被用于分析病人的血液樣本，血球計(jì)數(shù)板在過(guò)去幾百年中已經(jīng)得到一系列的重大發(fā)展，相比以前計(jì)數(shù)更為精確、使用更為簡(jiǎn)單，并最終形成了今天我們使用的樣子。現(xiàn)在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)仍然是所有細(xì)胞學(xué)研究的一個(gè)組成部分，然而其計(jì)數(shù)存在的問(wèn)題由于自身固有的設(shè)計(jì)和使用方法并沒(méi)有隨著時(shí)間而消失。我們?cè)谶@里將要列出造成血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)誤差的來(lái)源， 并將討論自動(dòng)化計(jì)數(shù)是如何消除這些問(wèn)題的。

血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)誤差的來(lái)源

1. 人工失誤(混勻、加樣、稀釋、計(jì)算錯(cuò)誤以及人工操作誤差)

a. 在對(duì)5個(gè)操作者的觀察中，操作錯(cuò)誤和隨機(jī)錯(cuò)誤分別占3.12%和7.8%[3]。

b. James M. Ramsey做了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，衡量取樣區(qū)和稀釋系數(shù)如何影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

他測(cè)試了3個(gè)取樣區(qū)面積(18, 9和4 mm2)及兩個(gè)稀釋系數(shù)(1:100 和 1:25)。取樣面積減小時(shí)CVs值是升高的，稀釋倍數(shù)的升高會(huì)降低CVs[4]。

 c. Bane 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同一個(gè)操作者去對(duì)同樣的兩份精液樣品計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果的差異55%歸因于取樣和移液?jiǎn)栴}， 45%歸因于計(jì)數(shù)室和細(xì)胞計(jì)數(shù)問(wèn)題 [5]。 Freund和Carol 展開(kāi)的另外一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，不同操作者之間的計(jì)數(shù)差異能高達(dá)52%，而同一個(gè)操作者的計(jì)數(shù)差異為20%[5]。

2. 多次計(jì)數(shù)以保證結(jié)果準(zhǔn)確性的必要性

a. 1907年， John C. DaCosta 聲明，為了得到精確的計(jì)數(shù)結(jié)果，很有必要取血液樣品中的多滴血液分別進(jìn)行計(jì)數(shù)[1]。

b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出結(jié)論， 為了得到10%, 15%和 20%的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性, ，必需的樣品數(shù)分別為7份, 3份和2份,每份樣品中分別包含180個(gè), 200個(gè)和125個(gè)細(xì)胞[6]。

c. 1881年， Lyon 和Thoma推測(cè)血球計(jì)數(shù)板的標(biāo)準(zhǔn)誤差為 ,其中n即計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目。

d. 1907年, William Sealy以“學(xué)生”的名義發(fā)布了他計(jì)數(shù)釀啤酒師的酵母的工作，他特地通過(guò)實(shí)驗(yàn)和數(shù)學(xué)模型計(jì)算了計(jì)數(shù)誤差，公式也為[7,8]。

3. 細(xì)胞均勻分布的要求

a. 1912年， James C. Todd將細(xì)胞分布不均勻列為計(jì)數(shù)誤差的問(wèn)題來(lái)源[1]。

b. 學(xué)生也說(shuō)有兩項(xiàng)主要的計(jì)數(shù)誤差來(lái)源，一為吸取的酵母樣品不能夠代表原液的濃度，另一個(gè)是隨機(jī)取樣時(shí)細(xì)胞在計(jì)數(shù)區(qū)域分布不均勻[7,8]。

c. 1947年, 一篇文章提到血球計(jì)數(shù)板中的細(xì)胞濃度分布不均勻問(wèn)題。初布的結(jié)果顯示，離進(jìn)樣口的濃度分別比平均濃度低3.5%和高3.5%[9]。

4. 儀器及材料差異(柵格，深度，蓋玻片，緩沖液類(lèi)型以及移液器) 

a. 結(jié)果顯示計(jì)數(shù)室的計(jì)數(shù)誤差和移液器（CV%）造成的計(jì)數(shù)誤差分別在大約4.6% 和4.7%[10]。

b. 在一項(xiàng)5個(gè)計(jì)數(shù)人員的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，移液器和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器造成的誤差分別為9.46% 和4.26%[3]。

c. 1961年, Sanders和Skerry得出結(jié)論，蓋玻片的位置能造成7.6%的計(jì)數(shù)差異[11]。 

d. 在關(guān)于不同稀釋步驟的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，隨著稀釋步驟的增加，變異系數(shù)升高，每個(gè)血細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)的誤差如下： Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)[12]。

解決血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)問(wèn)題

隨著新技術(shù)的發(fā)展，如計(jì)算機(jī)技術(shù)、自動(dòng)化軟件、光學(xué)鏡片、熒光染料、精密制造，以及現(xiàn)代技術(shù)如熒光顯微技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、圖像細(xì)胞術(shù)，自動(dòng)化已經(jīng)解決了血球計(jì)數(shù)板存在的許多問(wèn)題[13-25]。

自動(dòng)化計(jì)數(shù)解決：

人工操作誤差 - 為了解決這個(gè)問(wèn)題，自動(dòng)化和機(jī)器人技術(shù)能夠代替人工的樣品操作和計(jì)數(shù)操作。

加樣誤差 - 取樣區(qū)越多、計(jì)數(shù)細(xì)胞越多，隨機(jī)誤差越小，但是需要時(shí)間越多。通過(guò)應(yīng)用自動(dòng)取樣或者成像技術(shù)，成千上百萬(wàn)的細(xì)胞能在很短時(shí)間內(nèi)被分析，提高了效率，并把分析中的隨機(jī)誤差降到更低。 

移液和稀釋誤差 - 這些取決于操作者的操作經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)采用自動(dòng)加樣器或者自動(dòng)液流系統(tǒng)，這個(gè)誤差可以被降到更低[26]。

材料誤差 - 計(jì)數(shù)室的誤差是由于不同品牌的血球計(jì)數(shù)板或者同一品牌不同批次間的差異造成的。這也可以通過(guò)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的選擇，請(qǐng)查閱 http://dakewe.com/product/view/id-71.html 或百度文庫(kù) http://wenku.baidu.com/view/f13faf4916fc700abb68fc54.html  中《細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的選擇》一文）增加取樣量及減小隨機(jī)誤差來(lái)解決。

細(xì)胞分布不均勻 – 血球計(jì)數(shù)板不合適的清洗，或者蓋玻片放置不正確將會(huì)產(chǎn)生誤差。這些可以通過(guò)不使用計(jì)數(shù)室的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來(lái)消除，比如流式細(xì)胞儀。但是細(xì)胞樣品中若是存在細(xì)胞團(tuán)，基于液流計(jì)數(shù)的儀器將很難計(jì)數(shù)，而使用圖像計(jì)數(shù)儀，細(xì)胞團(tuán)可以使用圖像分析算法計(jì)數(shù)聚集的細(xì)胞，這樣可以提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

綜述

血球計(jì)數(shù)板幾百年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)研究中一直都是一個(gè)必備的工具，并且經(jīng)歷了很多的改進(jìn)形成了今天研究者們使用的樣子，然而它仍然會(huì)造成很多不可避免的計(jì)數(shù)誤差。今天，現(xiàn)代化的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的使用已經(jīng)很大程度上消除了許多出現(xiàn)誤差的來(lái)源，提高了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和效率。

參閱文獻(xiàn)

1. Davis  JD.  THE  HEMOCYTOMETER  AND  ITS  IMPACT  ON  PROGRESSIVE-ERA   MEDICINE.  Urbana:  University  of  Illinois  at  Urbana-Champaign;  1995.

2. Verso  ML.  Some  Nineteenth-Century  Pioneers  of  Haematology.  Medical  History  1971;  15(1):  55-67.

3. Biggs  R,  Macmillan  RL.  The  Errors  of  Some  Haematological  Methods  as  They  Are  Used  in  a  Routine  Laboratory.  Journal  of  Clinical  Pathology  1948;  1:  269-87.

4. Ramsey  JM.  The  Effects  of Size  of  Sampling  Area  and  Dilution  on  Leucocyte   Counts  in  a  Hemocytometer.  The  Ohio  Journal  of  Science  1969;  69(2):  101-4.

5. Freund  M,  Carol  B.  Factors  Affecting  Haemocytometer  Counts  of  Sperm  Concentration  in  Human  Semen.  Journal  of  Reproductive  Fertility  1964;  8:  149-55.

6. Nielsen  LK,  Smyth  GK,  Greenfield  PF.  Hemacytometer  Cell Count Distribution: Implications of  Non-Poisson  Behavior.  Biotechnology  Progress  1991;  7:  560-3.

7. Student.  On  the  Error  of  Counting  with  a  Haemacytometer.  Biometrika  1907;  5(3):  351-60.

8. Shapiro  HM.  "Cellular  Astronomy"  -  A  Foreseeable  Future  in  Cytometry.  Cytometry  Part  A  2004;  60A:  115-24.

9. Hynes  M.  The  Distribution  of  Leucocytes  on  the  Counting  Chamber.  Journal  of  Clinical  Pathology  1947;  1:  25-9.

10. Berkson  J,  Magath  TB,  Hurn  M.  The  Error  of  Estimate  of  the  Blood  Cell  Count  as  Made  with  the  Hemocytometer.  American  Journal  of  Physiology  1940;  128:  309-23.

11. Sanders  C,  Skerry  DW.  The  Distribution  of  Blood  Cells  on  Haemacytometer  Counting  Chambers  with  Special  Reference  to  the  Amended  British  Standards  Specification  748 (1958).  Journal  of  Clinical  Pathology  1961;  14:  298-304.

12. Christensen  P,  Stryhn H,  Hansen  C.  Discrepancies  in  the  Determination  of  Sperm  Concentration  using  Bürker-Türk,  Thoma  and  Makler  Counting  Chambers.  Theriogenology  2005;  63:  992-1003.

13. Al-Rubeai  M,  Welzenbach K,  Lloyd  DR,  Emery  AN.  A  Rapid  Method  for  Evaluation  of  Cell  Number  and  Viability  by  Flow Cytometry.  Cytotechnology  1997;  24:  161-8.

14. Fazal  SS.  A  test  for  a  Generalized  Poisson  Distribution.  Biometrical  Journal  1977;  19(4):  245-51.

15. Hansen  C,  Vermeiden  T,  Vermeiden  JPW,  Simmet  C,  Day  BC,  Feitsma  H.  Comparison  of  FACSCount  AF  system,  improved  neubauer  hemocytometer,  Corning  254  photometer,  SpermVision,  UltiMate  and  NucleoCounter  SP-100  for  determination  of  sperm  concentration  of  boar  semen.  Theriogenology  2006;  66(9):  2188-94.

16. Despotis  GJ,  Saleem  R,  Bigham  M,  Barnes  P.  Clinical  evaluation  of  a  new,  point-of-care  hemocytometer.  Critical  Care  Medicine  2000;  28(4):  1185-90.

17. Paulenz  H,  Grevle  IS,  Tverdal  A,  Hofmo  PO,  Berg  KA.  Precision  of  the  Coulter(R)  Counter  for  Routine  Assessment  of  Boar-Sperm  Concentration  in   Comparison  with  the  Hemocytometer  and  Spectrophotometer.  Reproduction  in  Domestic  Animals  1995;  30(3):  107-11.

18. Lutz  P,  Dzik  WH.  Large-Volume  Hemocytometer  Chamber  for  Accurate  Counting  of  White  Cells  (Wbcs)  in  Wbc-Reduced  Platelets - Validation  and  Application  for  Quality-Control  of  Wbc-Reduced  Platelets  Prepared  by  Apheresis  and  Filtration.  Transfusion  1993;  33(5):  409-12.

19. Brecher  ME,  Harbaugh  CA,  Pineda  AA.  Accurate  Counting  of  Low  Numbers  of  Leukocytes-Use  of  Flow-Cytometry  and  a  Manual  Low-Count  Chamber.  American  Journal  of  Clinical  Pathology  1992;  97(6):  872-5.

20. Vachula  M,  Simpson  SJ,  Martinson  JA,  et  al.  A  Flow  Cytometric  Method  for  Counting  Very  Low-Levels  of  White  Cells  in  Blood  and  Blood  Components.  Transfusion  1993;  33(3):  262-7.

21. Szabo  SE,  Monroe  SL,  Fiorino  S,  Bitzan  J,  Loper  K.  Evaluation  of  an  Automated  Instrument  for  Viability  and  Concentration  Measurements  of  Cryopreserved  Hematopoietic  Cells.  Laboratory  Hematology  2004;  10:  109-11.

22. Chan  LL,  Wilkinson  AR,  Paradis  BD,  Lai  N.  Rapid  Image-based  Cytometry  for  Comparison  of  Fluorescent  Viability  Staining  Methods.  Journal  of  Fluorescence  2012;  22:  1301-11.

23. Chan  LL,  Zhong  X,  Qiu  J,  Li  PY,  Lin  B.  Cellometer  Vision  as  an  alternative  to  flow  cytometry  for  cell  cycle  analysis,  mitochondrial  potential,  and  immunophenotyping.  Cytom  Part  A  2011;  79A(7):  507-17.

24. Chan  LL-Y,  Lai  N,  Wang  E,  Smith  T,  Yang  X,  Lin  B.  A  rapid  detection  method  for  apoptosis  and  necrosis  measurement  using  the  Cellometer  imaging  cytometry.  Apoptosis  2011;  16(12):  1295-303.

25. Bocker  W,  Gantenberg  HW,  Muller  WU,  Streffer  C.  Automated  cell  cycle  analysis  with  fluorescence  microscopy  and  image  analysis.  Physics  in  Medicine  and  Biology  1996;  41(3):  523-37.

26. Macfarlane  RG,  Payne  AM-M,  Poole  JCF,  Tomlinson  AH,  Wolff  HS.  An  Automatic  Apparatus  for  Counting  Red  Blood  Cells.  British  Journal  of  Haemacytology  1959;  5:  1-15.

供稿人：達(dá)科為生物技術(shù)有限公司

聯(lián)系人：肖女士

電話(huà)：0755-26410151

郵箱：equipment@dakewe.com

網(wǎng)址：www.dakewe.com