TurboTEV蛋白酶含有煙草蝕刻病毒（TEV） N1a蛋白催化片段的增強(qiáng)形式，其為半胱氨酸蛋白酶，可識(shí)別Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly的切割位點(diǎn)，并在Gln和Gly之間切割。TurboTEV蛋白酶是一種限制性蛋白酶，在4°C下具有很強(qiáng)的活性，具有高特異性和很強(qiáng)的穩(wěn)定性。它的活性不需要任何特殊的緩沖液，可以在最適合目標(biāo)蛋白的緩沖液中使用。

TurboTEV蛋白酶是一種52 kDa的蛋白，具有GST和His標(biāo)簽，因此可以很容易地通過Ni螯合或谷胱甘肽（GSH）樹脂與剪切標(biāo)簽一起去除。

（一）來源及活性

來源：大腸桿菌

活性：＞10 Units/μg。1單位TurboTEV蛋白酶在30℃下1小時(shí)內(nèi)裂解3μg對(duì)照底物的85%。

（二）Protocol

1、在溶液中裂解

A、配制新鮮的冰冷透析緩沖液

透析緩沖液的一個(gè)示例：25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 - 500 mM NaCl, 14 mM β-巰基乙醇。

B、稀釋目標(biāo)蛋白樣品池

（a）用透析緩沖液將目標(biāo)蛋白樣品池稀釋至 1-2 mg/mL。

注意：如果目標(biāo)蛋白在透析緩沖液中發(fā)生聚集，此步驟可選擇不進(jìn)行。

（b）留出一小份未切割樣品用于分析。如果目標(biāo)蛋白樣品池是從鎳柱上洗脫下來的，并且 EDTA 與目標(biāo)蛋白兼容，則可加入 EDTA，使其最終濃度達(dá)到 0.5 mM。

C、加 TurboTEV 蛋白酶

按照蛋白酶與目標(biāo)蛋白 1:100（w/w）的比例加入 TurboTEV 蛋白酶，即 100 mg目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng) 10000 Units（1 mg）TurboTEV 蛋白酶。

D、透析

4 ℃下，用透析緩沖液透析過夜（約 16 小時(shí)）。

2、去除 TurboTEV 蛋白酶

A、上柱

3、SDS-PAGE分析（可選）

（三）產(chǎn)品應(yīng)用：

? 蛋白裂解功能；

? 從重組蛋白中去除融合標(biāo)簽；

? 蛋白質(zhì)和肽的純化

（四）常見FAQ

1、問：對(duì)于TEV消化反應(yīng)，方案說明反應(yīng)在25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl和14 mM β -巰基乙醇中進(jìn)行。想知道這些緩沖液條件有多重要，是否存在以下任何一種可能會(huì)對(duì)TurboTEV的剪切效率產(chǎn)生不利影響？

(a) 1mM DTT

(b) 10%甘油

(c) 20mM組氨酸

(d) 500 mM NaCl

(e) 100mM Tris-HCl

(f) β-巰基乙醇的加入

答：

(a) 1mM的DTT就可以；

(b)不推薦使用10%的甘油；

(c)不推薦20 mM組氨酸；

(d)不建議使用500mM NaCl；

(e)不建議使用100mM Tris；

(f) β-巰基乙醇的功能與DTT類似，可以加入β-巰基乙醇。

2、問：在剪切之前，需要緩沖液交換蛋白質(zhì)嗎？

答：這可能是必要的。

（五）產(chǎn)品引用文獻(xiàn)

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